심상희, 2018, 단일분자 위치측정을 이용한 초해상도 형광 현미경법

# 세줄 요약 #

• 형광 현미경은 형광물질의 방출빛 만을 선택적으로 검출함으로써 높은 감도로 특정 분자만을 선택적으로 가시화할 수 있어 현대 생물학의 필수도구가 되었으나, 단일 분자의 경우 가시광의 회절 무늬보다 훨씬 작기 때문에 단일 분자의 이미지는 광학적 회절현상으로 결정되어 수백 나노미터의 회절 무늬를 가지는 한계가 있었다.
• 그러나 이미지가 겹치치 않을 정도의 소수의 분자들만 일시적으로 형광을 켜고 끌 수 있다면 이들의 위치를 정확하게 알 수 있으므로, 빛에 의하여 끄고 켤 수 있는 유기 염료나 형광 단백질을 사용하여 분자들을 끄고 켜면서 정확하게 그 위치를 측정하고 전체 구조를 초고해상도 이미지로 재현하는 형광 현미경법을 STORM(stochastic reconstruction microscopy)이라고 부른다.
• 생체 내 미세구조를 단일 분자 레벨에서 볼 수 있는 STORM은 기존의 분자생물학, 생화학, 세포생물학 기술을 보완하여 생체 내 분자들의 동적 상호 작용에 관한 우리의 이해를 크게 넓히는데 기여할 것으로 기대된다.

 

# 상세 리뷰 #

1. 서론

• 형광 현미경은 형광물질의 방출빛 만을 선택적으로 검출함으로써, 높은 감도로 특정 분자만을 선택적으로 가시화할 수 있어 현대 생물학의 필수도구가 되었다.
• 단일 분자의 경우 가시광의 회절 무늬보다 훨씬 작기 때문에, 단일 분자의 이미지는 광학적 회절현상으로 결정되어 수백 나노미터의 회절 무늬를 가지는 한계가 있었으나, 2000년대 초반부터 형광분자 고유의 화학적 성질을 이용하여 다양한 방법으로 극복하는 초해상도 형광현미경법(Super-resolution fluorescence microscopy)이 개발되었다.
• 여러 초해상도 형광현미경법 중에 한 주류는 2006년에 소개된 형광분자들을 임의로 끄고 켜는 방법을 활용하여 분자들을 시간축 상에서 분리함으로써, 분해능의 한계를 극복하는 STORM(Stochastic Reconstruction Microscopy) 기법이다.

 

 

2. 본론

2.1. 단일 분자의 초정밀 위치 측정

• 모든 생물학적 구조는 이를 이루는 각각의 분자들의 위치로 결정되기에, 각 형광분자들의 위치를 모두 정확하게 측정하면 형광물질로 표지된 생물학적 구조를 높은 해상도의 이미지로 알 수 있을 것이다. 
• 그러나 형광분자에서 방출된 광자들은 아쉽게도 빛의 회절 현상 때문에 현미경 렌즈의 초점 면에서 한점으로 모이지 않고, 유한한 크기의 원형의 회절무늬를 형성한다.
  • 회절무늬 크기는 빛의 파장에 비례하고, 대물렌즈의 조리개수에 반비례한다.
• 하지만 한 현미경에서 얻은 모든 형광분자의 이미지는 모두 같은 모양, 같은 폭을 가지게 되므로, 단일 분자들의 이미지에 알려진 회절무늬의 모양을 맞추어 분자의 중심 위치를 정확하게 측정할 수 있다.
  • 위치 측정의 정확도: a/sqrt(N)   (* a: 회절무늬의 폭, N: 광자의 수)
  • 한개의 광자로 측정할 때마다 회절무늬의 폭만큼의 부정확도가 존재하며, 따라서 많은 수의 광자를 방출하는 분자의 중심 위치는 회절 한계보다 훨씬 높은 정확도로 알아낼 수 있다.
  • 다만 여러 개의 분자가 가까이 위치하여 그 이미지가 겹치기 시작하면 위치 측정이 부정확해진다.

 

2.2. 확률적 스위칭을 통하여 회절한계를 극복하다.

• 대부분의 생체 샘플에는 수만개의 형광분자들이 모여있기에 단분자 위치측정법으로는 분석이 불가능하지만, 이미지가 겹치치 않을 정도의 소수의 분자들만 일시적으로 형광을 켜고 끌 수 있다면, 이들의 위치를 정확하게 알 수 있다.
• 빛에 의하여 끄고 켤 수 있는 유기 염료나 형광 단백질을 사용하여, 분자들을 끄고 켜면서 정확하게 그 위치를 측정하는 과정을 반복하여 모든 분자들의 위치를 알아냄으로서, 전체 구조를 초고해상도 이미지로 재현하는 형광 현미경법을 STORM, PALM, FPALM 등으로 부른다.
• 광스위칭이 가능한 형광물질들은 형광을 일으키는 빛의 세기가 강하면 꺼지고(들뜸; excitation), 다른 파장의 빛이 들어오면 형광 상태로 켜지며(활성화; activation), 이러한 스위칭 과정은 확률에 비례하여 임의로 일어나고, 이렇게 시간적으로 분리된 분자들의 위치를 종합하여 구조를 재현하기에 STORM(stochastic reconstruction microscopy)이라고 부른다. (그림 1)
  • 형광이 꺼지는 확률은 형광을 일으키는 들뜸(excitation) 빛의 세기에 비례
  • 형광이 활성화되는 활률은 활성화(activation) 빛의 세기에 비례

* [Ref.] 심상희.(2018).단일분자 위치측정을 이용한 초해상도 형광 현미경법.고분자 과학과 기술,29(3),247-252.

 

2.3. 형광 탐침

• STORM 이미지에 사용될 수 있는 형광탐침의 조건
  • 1. STORM 탐침은 특정 파장대의 형광빛을 방출하지 않는 꺼진 상태를 가져야 한다.
  • 2. 높은 해상도를 얻기 위해서는 켜진 후 꺼질 때까지 많은 수의 광자를 방출하여야 한다.
  • 3. 정확한 위치 측정을 위해서 회절 한계 면적 내에 단 한 개의 분자만 켜져 있어야 하므로 대다수의 분자들은 꺼진 상태에 있어야 한다.
• 형광 탐침의 종류
  • 형광 단백질
    • 장점: 생체 내의 단백질을 유전적으로 표지하여 살아 있는 세포에서 발현할 수 있다
    • 단점: 방출 광자수가 적기 때문에 해상도 낮은 편
  • 유기 염료
    • 장점:
      • 대개 밝고 안정하며, 단백질 외에도 핵산, 당류, 지질, 약물 등의 작은 분자들을 표지할 수 있다.
      • 항체를 사용하면 유기염료로 생체 내 단백질을 표지할 수 있다.
    • 단점:
      • 항체의 크기가 10-15nm에 달하기 때문에 STORM 이미지 속 구조의 크기가 인공적으로 늘어날 수 있다.
      • 살아있는 세포를 표지하기 어렵다.

 

2.4. 다색 이미징

• STORM 탐침들은 다양한 스펙트럼에 걸쳐 개발되어 있으므로, 이들을 조합하여 다색 이미지를 얻을 수 있다. (그림 2A)
• 스펙트럼이 겹치지 않는 형광물질들을 조합하면 색간의 혼선이 거의 없는 다색 이미지를 4가지 색까지 얻을 수 있다. (그림 2B)
  • 스펙트럼이 겹치는 형광물질들도 프리즘을 분광계로 활용하여 단일 분자의 스펙트럼을 측정함으로써, 단일 광원을 사용하고 스펙트럼 간격이 10nm 밖에 되지 않는 형광체를 구분하여 4색 이미지를 얻을 수 있다.

* [Ref.] 심상희.(2018).단일분자 위치측정을 이용한 초해상도 형광 현미경법.고분자 과학과 기술,29(3),247-252.

 

2.5. 3차원 이미징

• 3차원 STORM 이미지는 기존의 2차원 위치에 추가하여 대물렌즈의 축 방향의 위치를 알아낼 수 있는 방법을 고안하면, 각 분자의 위치를 3차원으로 측정함으로써 얻을 수 있다.
• 최초의 3차원 STROM 기술 (그림 3A)
  • 카메라 앞에 원통형 렌즈를 끼워넣어 비점수차(astigmatism)을 이용하는 방법
  • 단분자의 축상 위치에 따라 달라지는 가로 또는 세로로 긴 타원형의 모양으로부터 축방향 위치를 얻어 3차원의 위치를 결정할 수 있다.
  • 해상도: 측면 20nm, 축방향 50nm (그림 3B)
• 3차원의 이미지를 얻는 가장 해상도가 높은 방법
  • 두개의 정반대 방향으로 놓인 대물렌즈에서 얻은 이미지들의 간섭(interferometry) 현상을 이용
  • 각 분자의 위치에 따라 두 대물렌즈를 통과한 경로의 길이가 달라지므로 그 간섭된 빛의 세기가 달라지는 것을 관찰하여 축방향 위치를 결정
  • 해상도: '광자수가 적은 형광단백질에서도' 축방향 10nm

* [Ref.] 심상희.(2018).단일분자 위치측정을 이용한 초해상도 형광 현미경법.고분자 과학과 기술,29(3),247-252.

 

2.6. 살아있는 세포의 이미징

• 초고해상도 형광현미경법의 차별화된 장점: 살아있는 세포에서도 특정 분자의 초고해상도 이미지를 얻을 수 있다.
  • 그러나 STORM에서는 분자들을 시간상으로 분리하여 이미지를 축적하기 때문에 이미징 속도가 느리고, 장기간 축적할 수록 많은 광자를 얻을 수 있기에 시간과 공간 해상도 상충되는 문제점을 가지고 있다.
  • 따라서 살아있는 세포의 이미징의 경우 광스위칭 간격이 빠른 유기물질을 형광단백질 대신 사용하기도 한다.
• 시간 해상도를 높이는 기법: 단일분자의 이미지가 다소 겹치더라도 수치적으로 분리할 수 있는 분석법 사용
  • 같은 이미지에서 위치측정과 이미지 감산을 반복
  • 이미지들의 순차적인 정보를 이용하여 앞뒤의 이미지 제거
  • 전체적으로 분자들의 위치의 확률을 추론

 

2.7. 응용

• STORM은 세포생물학 뿐 아니라 면역학, 미생물학, 신경생물학에 걸친 생물학 전반에 다양하게 적용되고 있다.
• 사례
  • 진핵생물의 단백질 복합체: 복합체의 단백질 구성원들의 위치를 10nm 해상도로 측정 (그림 4A)
  • 단백질 복합체의 다층구조: 외부부착-신호전달-힘전달-액틴조절의 여러 기능의 다층 구조로 이루어져 있음을 분자 수준으로 밝힘 (그림 4B)
  • 살아있는 미생물 내부의 구조를 초고해상도로 제공: 대장균의 유전자 조절 단백질의 공간 구조를 연구하여 유전자 발현을 조절하는 기작 발견 (그림 4C)
  • 뉴런 세포들이 다른 뉴런들과 소통하기 위해 형성하는 시냅스: 광유전학(optogenetics)와 3D STORM을 결합하여 외부 자극에 의하여 시냅스의 구조와 수용체의 구성/구조가 어떻게 변화하는지를 단일 시냅스 상에서 관찰 (그림 4B)

* [Ref.] 심상희.(2018).단일분자 위치측정을 이용한 초해상도 형광 현미경법.고분자 과학과 기술,29(3),247-252.

 

 

3. 결론

• 광스위칭 형광물질을 이용하여 분자들의 이미지를 시간상으로 분리하고 단일분자들의 위치를 정확하게 측정하면 STORM 이미지를 얻을 수 있다.
  • 기존 단분자 검출 현미경에 형광물질과 분석법을 바꾸는 것만으로도 10배 이상 개선된 초고해상도를 구현할 수 있다.
  • 다른 촉해상도 형광현밍경법에 비하여 비교적 간단한 기기장치를 사용하면서도 더 향상된 해상도(10~20nm)를 제공한다.
• 이러한 STORM의 해상도는 이론적으로는 무한히 개선될 수 있기에, STORM 기술에는 아직 발전의 여지가 남아있다.
  • 보다 많은 광자를 얻을 수 있는 광스위칭 형광물질을 개발하면 그에 비례하여 해상도를 개선시킬 수 있다.
  • 다양한 표지 방법의 개발을 통해 시공간 해상도를 개선시키고 단백질 외의 생체 물질도 초고해상도로 분석할 수 있을 것이다.
  • 마지막으로 단일 분자를 쉽게 분리할 수 있는 점을 활용, 여러 생체 시스템의 물리 화학적 성질들을 세포에서 단일 분자 수준으로 알아낼 수 있을 것이다.
• 생체 내 미세구조를 단일 분자 레벨에서 볼 수 있는 STORM은 기존의 분자생물학, 생화학, 세포생물학 기술을 보완하여 생체 내 분자들의 동적 상호 작용에 관한 우리의 이해를 크게 넓히는데 기여할 것으로 기대된다.

 

 

# Reference: 심상희.(2018).단일분자 위치측정을 이용한 초해상도 형광 현미경법.고분자 과학과 기술,29(3),247-252.