(* 작성 중...;~2022.11.23)
# 세줄 요약 #
- 저자들은 최근에 개발된 현미경 영상의 공간 해상도를 향상시킨 초해상도 현미경법의 원리를 소개하고 있다.
- 이러한 초해상도 기술들은 빛과 형광탐침(fluorescent probes)들의 상호작용을 이용하여 회절 장벽(diffraction barrier)을 깸으로서 공간해상도의 한계를 극복할 수 있었다.
- 이러한 각각의 초해상도 현미경법 영상처리 기술의 특징들을 기존의 전통적인 영상처리 기술들과 비교해볼 것이다.
# 상세 리뷰 #
1. Introduction
- 광학 현미경은 우리가 미생물, 세포, 조직과 장기 등을 살아있는 상태에서 영상을 찍어 조사가 가능하도록 하였기에, 생물학과 의학 분야에서 매우 중요한 도구로 사용되고 있다.
- 특히 형광 탐침(fluorescent probes)을 이용한 형광현미경법이 개발되면서 더욱 자주 쓰이게 되었다.
- 그러나 전통적인 광학현미경은 공간해상도가 샘플을 조사하는데 사용되는 빛의 파장의 절반으로 제한된다는 한계를 가지고 있다.
- 빛은 광원(point source)에서 출발하였다 하여도 전자기파(electromagnetic wave)이기 때문에, 빛의 파장의 절반 이하로 빛이 모이지 않는다(Fig 1. 참고).
- 이렇게 결정된 공간 해상도의 한계를 회절한계(diffraction limit)이라고 부른다.
- 저자들은 이번 리뷰 논문에서 이러한 회절한계를 넘어 공간해상도를 향상시킨 새로운 광학현미경법들을 소개하고 있다.
- 이 새로운 현미경법들의 핵심은 형광탐침의 광스위칭(photo-switching; 일부 형광탐침만 껏다가 켰다가 반복하는 것)과 형광 방출(fluorescence emission)의 비선형 반응 등을 이용하는 것이다.
- 새로운 현미경법들과 이 현미경법에 주로 사용된 원리 등은 아래의 표(Table 1)로 정리하였다.
2. Image formation in fluorescence microscopy
- 형광현미경법에는 크게 두가지 종류의 방법이 존재하는데, 하나는 'wide-field' 현미경법이고, 다른 하나는 'laser scanning' 현미경법이다.
- 문제는 이 두가지 기술이 서로 다름에도 불구하고 회절한계(diffraction limit)로 인해 비슷한 수준의 공간 해상도 한계를 가지고 있다.
- 1. Wide-field fluorescence microscopy: 관찰하고자하는 샘플을 시야 전체에서 동일한 밝기의 조명으로 빛추어 형광시킨다.
- 이때 회절한계로 인해 인접한 형광탐침의 회절무늬(diffraction pattern -> Airy disk)는 중첩되는 현상이 발생하기에 공간해상도는 한계를 가질 수 밖에 없다(그림 2 참고).
- 2. Laser scanning microscopy: 레이저의 초점에 들어온 형광분자들만 흥분시켜(excited) 빛을 얻기에 각 픽셀별로, 말 그대로 스캔하듯이 영상을 얻게 된다.
- 그러나 레이저가 형광시키는 excitation spot에 여러 형광분자가 있는 경우 결국 회절 무늬가 겹치기에 공간해상도의 한계가 발생하는 것은 동일하다.
3. Localization microscopy
- 전통적인 형광현미경법에서는 형광탐침들이 회절한계로 인해 중첩되는 것이 문제였으므로, 초해상도 영상을 얻기 위한 핵심 기술은 바로 광전환 탐침(Photoswitchable probes)을 사용하여, 영상 내에서 일부의 형광탐침들만 켜고 끔으로서 중첩되는 형광탐침의 수를 줄이는 것이다.
- 광전환 탐침의 경우에는 처음에는 꺼져있지만, 각 형광탐침은 조명(irradiation)되는 광선의 특정 파장대(emission wavelength)에만 흡수방출(light absorption & light emission)하는 특징을 가지고 있기에, 이 특정 파장대의 약한 광선을 비추어주면 일부만 형광되고, 다른 형광탐침들은 꺼져있다.
- 이렇게 특정파장대별로 일부만 켜진 광전환 탐침들의 단분자영상(single molecule images)을 여러장 모아서 영상처리 후 합성해주면 초해상도 영상을 구현할 수 있는 것이다.
- 따라서 이러한 단분자영상 여러장을 모을수록 더욱 높은 해상도의 초해상도 영상을 얻을 수 있기에, 성능을 높이기 위해서는 각 단분자영상의 시간당 획득률(frame rate of image acquisition)을 높이거나, 중첩된 탐침들이 다소 발생하더라도 한 영상 내에 형광된 단분자(single molecule)의 수를 늘리는 방법 등이 존재한다.
- 이러한 localization 기반의 초해상도 기법들은 서로 다른 3개의 그룹에서 2006년에 동시에 발표하였다: Photoactivation localization microscopy (PALM), Fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM), Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).
- 이중 PALM과 FPALM은 형광탐침으로 PA-FP와 같은 광전환 형광 단백질을 사용하였고, STORM의 경우에는 Cy3-Cy5와 같은 한쌍의 합성분자(synthetic dyes)들을 사용하였다.
- 이 3가지 기법은 각기 다른 형광탐침을 사용하고 기술적으로도 미세한 차이가 있지만, 초해상도 영상을 얻는 핵심원리는 모두 동일하기에 'Localization Microscopy'라고 부른다.
- Localization microscopy의 공간해상도는 위치 측정(localization)의 정확도에 따라 결정되며, 일반적인 2D Gaussian fitting에서 정밀도는 ⍺/sqrt(N)으로 정해진다(* ⍺: 탐침 위치의 표준 편차, N: 광자수; 따라서 공간해상도는 최대 회절한계만큼의 오차를 가지며, 각 탐침에서 측정되는 광자의 수가 많을수록 정밀도가 상승한다).
- 'Localization Microscopy'는 위 3 그룹의 발표 이후로, 성능이 개선된 다양한 기법들이 소개되었고, 생물학 분야에서도 널리 응용되고 있다.
- 대표적으로 3차원 초해상도 형광현미경법도 개발되어, cylindrical lens를 사용하여 발생한 수차로 인해, z축에 깊이에 따른 형광 탐침의 PSF 모양을 계산하여 3차원 초해상도 영상도 얻을 수 있었다.
- 생물학 분야에서는 이러한 PALM, STORM과 같은 초해상도 형광현미경법 기술로 인해 세포 내의 미세구조까지 관찰할 수 있게 되었다.
4. Structured illumination microscopy
5. Another microscopy: STED/RESOLFT/GSD/SAX
* 참고문헌: Yamanaka, Masahito, Nicholas I. Smith, and Katsumasa Fujita. "Introduction to super-resolution microscopy." Microscopy 63.3 (2014): 177-192.
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