# 세줄 요약 #
1. Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM)은 이미징 속도가 빠르고 배경 제거(background removal)에도 탁월하여 널리 쓰이는 이미징 방법이지만, 일반적으로 excitation/detection의 방향이 직교(orthogonal)하도록 현미경을 설계하여 생기는 구조적인 문제로 인해 single-cell imaging에 사용하기 힘들다.
2. 저자들은 배경을 제거하고 높은 처리량(high-throughput)을 가진 새로운 형광현미경법(fluorescence imaging)인 "The Immersion Tilted Light Sheet Microscopy" (ImTLSM)을 제안함으로서, 단분자(single molecule) 검출 감도와 해상도를 유지하면서도 각각의 세포들을 광학적으로 구분하여 관찰할 수 있음을 보였다.
3. 그리고 딥러닝 모델을 이용하여 epi-illumination 이미지에 ImTLSM illumination 이미지를 매핑함으로써(개발한 딥러닝 모델은 PN-ImTLSM이라 명명하였음), epi-illumination 영상을 모달리티의 한계를 넘어(cross-modality), 배경이 제거되고 높은 처리량(high-throughput)을 가진 넓은 영역의 균일한 조명(large-field homogeneous illumination) 영상으로 변환시켰다.
# 상세 리뷰 #
1. Introduction: LSFM의 한계
"Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM)은 이미징 속도가 빠르고 배경 제거(background removal)에도 탁월하여 널리 쓰이는 이미징 방법이지만, 일반적으로 excitation/detection의 방향이 직교(orthogonal)하도록 현미경을 설계하여 생기는 구조적인 문제로 인해 single-cell imaging에 사용하기 힘들다."
- Light-sheet illumination은 빠른 이미징 속도와 초점에서 벗어난 배경 영역이 적기에, 세포핵(cell nucleus)과 같은 넓은 영역(wide-field) 이미징에 자주 사용되는 방법이다.
- 하지만 LSFM으로 물체(세포핵)를 검출하고자 할때 존재하는 기하적 장애물이 얇은 light-sheet illumination과 높은 Numerical aperture (NA)이 조합되는 것을 방해하기에, signal-to-background ratio (SBR)과 fluorescence collection efficiency 간에 trade-off가 발생한다 (문제는 세포핵 내부 영역(intra-nucleus) 이미징에는 높은 SBR과 높은 fluorescence collection efficiency가 모두 필요하다).
- 이러한 기하하적인 장애물들을 다루기 위해서 여러가지 light sheet 조명법들이 개발되었으나(Reflected light-sheet microscopy (RLSM), Lattice light-sheet microscopy (LLSM), Tilted light sheet microscopy with 3D point spread functions (TILT3D)), 이전까지 존재한 많은 방법들은 복잡하고 낮은 처리량(low-throughput)을 가지는 한계에서 벗어나지 못했다.
2. Result: The Immersion Tilted Light Sheet Microscopy (ImTLSM)
"저자들은 배경을 제거하고 높은 처리량(high-throughput)을 가진 새로운 형광현미경법(fluorescence imaging)인 "The Immersion Tilted Light Sheet Microscopy" (ImTLSM)을 제안함으로서, 단분자(single molecule) 검출 감도와 해상도를 유지하면서도 각각의 세포들을 광학적으로 구분하여 관찰할 수 있음을 보였다."
- ImTLSM의 핵심은 light-sheet illumination을 기울여서 타겟을 비춤으로서, 초점면에서 어느 정도의 두께(Thickness)를 갖추면서도 effective field of view (eFOV) 영역을 가지게 된다(* deep Thickness -> high NA, wide eFOV -> high throughput(fluorescence collection efficiency).
- ImTLSM과 전통적인 epi-illumination 영상을 다양한 세포들(immuno-fluorescently labelled NCL protein)에서 비교한 결과, 배경이 잘 제거 되면서도(SBR 향상) 높은 data collection efficiency를 보였다(NCL protein 영상의 경우 epi-illumination에서는 보이지 않는 중앙의 빈 영역(hollow)이 ImTLSM에서는 잘 나타나는 것을 확인).
- ImTLSM의 높은 data collection efficiency 때문에, high-throughput의 좋은 화질의 영상을 빠른 속도로 얻을 수 있기에 이후에 딥러닝에 사용될 훈련 데이터셋으로도 많은 영상을 확보할 수 있었다.
3. Result: 딥러닝을 활용하여 epi-illumination 영상을 ImTLSM 영상으로 변환
"그리고 딥러닝 모델을 이용하여 epi-illumination 이미지에 ImTLSM illumination 이미지를 매핑함으로써(개발한 딥러닝 모델은 PN-ImTLSM이라 명명하였음), epi-illumination 영상을 모달리티의 한계를 넘어(cross-modality), 배경이 제거되고 높은 처리량(high-throughput)을 가진 넓은 영역의 균일한 조명(large-field homogeneous illumination) 영상으로 변환시켰다."
- 저자들은 PReNet(Ren et al., 2019, CVPR) 모델을 조금 수정하고, 2,400개의 형광이미지 조합(input - epi-illumination, target - ImTLSM)을 학습시켜, 배경을 제거시키는 모델인 PN-ImTLSM을 개발했다.
- PN-ImTLSM은 딥러닝으로 학습된 모델로 전통적인 배경 제거 기법으로 처리된 영상과 비교하여. 훨씬 배경이 줄어든 영상을 epi-illumination 이미지에서 ImTLSM 영상과 비슷한 수준의 prediction 영상을 만들어냈다.
- PN-ImTLSM을 ImageJ 툴의 전통적인 배경 제거 영상 처리 기법이랑 비교한 결과, 같은 수의 SMLM frame들에 대해서 ImTLSM이 전통적인 배경 제거 방식보다 localization 정확도는 두배 정도 높음과 동시에 속도도 두배 정도 빠른 것으로 나타났다 (세포핵 영상의 경우 특히 edge에서 배경이 잘 제거되고 localization도 잘 됨을 확인).
* Reference: Boxin, Xue, et al. "PN-ImTLSM facilitates high-throughput low background single-molecule localization microscopy deep in the cell." Biophysics Reports 7.4 (2021): 313-325.
- [1] Chatterjee, Krishnendu & Pratiwi, Feby & Wu, Frances Camille & Chen, Peilin & Chen, Bi-Chang. (2018). Recent Progress in Light Sheet Microscopy for Biological Applications. Applied Spectroscopy. 72. 000370281877885.10.1177/0003702818778851.
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